液相色谱分析方法开发，你学会了吗？

高效液相色谱分析中，色谱柱的选择直接影响了分离效果的好坏，选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需的时间，并且使方法更具稳定性。但是我们要清楚现在商品化的液相色谱柱比比皆是，根据色谱柱的参数可以给我们提供一个初步的选择，但由于各个仪器厂商的填料技术和键合技术都有差异。即使都是C18柱，不同品牌、同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高温的、有适合碱性样品的等等。那就要求我们要对各种类型的色谱柱做充分的了解之后，才能做出合适的选择。下面我们来讲讲如何选择色谱柱吧！

选择色谱柱时我们首先要考虑的就是选择填料的孔径大小，这怎么来选择呢，那么我们就要对自己所分析的物质做充分的了解，首先要知道的就是被分析物的分子量，对于分子量＜2000的小分子物质我们选择孔径80 - 120 孔径的填料， 而对于分子量 ＞2000多肽和蛋白质类物质则需要300 孔径的填料对其进行等度或梯度分离。选择到合适孔径大小的填料之后我们才能够保证目标分子能进入填料，在空隙中与疏水性固定相发生相互作用。

选择完填料的粒径之后，我们就到了选择键合相的环节，这一步呢我们就需要多做实验多试，大多数色谱工作都是从C18键合相开始的，在这里呢，我也建议大家将C18作为开始分析的键合相，因为其可以*大限度地保留中等极性到非极性化合物。如果用 C18 键合相不能优化分离度，或要分析的是蛋白质，或用常规反相溶剂很难从C18上洗脱的强疏水化合物，这时候可以考虑使用短链键合相如：C8、C3。

色谱柱填料的粒径，影响色谱分离度。粒径越小，分离越快，柱效越高，但柱压力越高，柱容易被污染，导致柱寿命降低。常见分析柱通常使用5um填料，复杂的多组分样品分离一般使用3.5um粒径，更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3.5um的色谱柱的背压却是5um的2倍，因此如何选择填料粒径需要我们根据实际情况而定。

在这里我们要清楚柱越长，分离度越高，但柱压更高，分离所需时间更长；如果想要得到较高的分离度，在压力和时间允许的情况下尽量选择长柱，如250mm。如果想要缩短分析时间并且对分离度的要求不高，建议大家使用短柱，可以节约时间，如50mm。

一般来说，反相LC 的流动相包括水和作为改性剂的乙腈或甲醇。改性剂还有四氢呋喃（THF）和异丙醇。反相色谱中流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随 pH 改变而明显变化。在这类反相系统中，控制 pH 对于保留和选择性的稳定非常重要。通常在 pH 2 到 4 条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性*高，因此色谱工作者将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。

为了有较好的重现性，所用的 pH 应高于或低于待分离溶质pKa或pKb上下一个pH单位。如果不清楚分析物的pKa，建议大家测试一种以上流动相 pH 可提供*好结果。大多数反相柱都可以在pH 2-8条件下使用，这样为分离选择*佳流动相 pH 提供了较宽的范围。流动相 pH 对色谱分离的影响有多种方式。根据所分析的化合物，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随 pH的改变变化非常明显，如果是非极性较强或中性的化合物，pH 对分离度和保留的影响一般不明显。

在开发可离子化分析物的分析方法时，我们一定要清楚非离子化形态的分析物比离子化形态的分析物保留更好，所以我们调节流动相的pH值，其目的就是防止可离子化分析物离子化。对于酸性分析物而言，应选择低 pH 缓冲液流动相，以防止分析物离子化。我们了解了分析物的 pKa，才能够有效地选 择流动相 pH。缓冲范围应在其缓冲液离子 pK 值的 +/-1 pH 单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如， 醋酸盐的 pKa 为 4.8，缓冲范围从 pH 3.8-5.8。甲酸盐的酸性较大，缓冲范围为 pH 2.8-4.8。对于碱性化合物而言，在高 pH 条件下才能得到其非离子化形态，但这对色谱柱不利。但许多碱性化合物在 低 pH 条件下的保留就已经足够了。因此，虽然非离子化形态能得到更高的保留，但这对与所有的碱性化合物并不是实用和必要的。在流动相的选择这一块以下几点相当重要，恕小编冒昧，请大家烂熟于心哦。

• 离子抑制形态下的分析物具有更好的保留（例如，低pH下的酸和高pH下的碱） 。

• 在中性和较高pH下，硅胶上的硅醇基发生离子化，增加了碱性分析物的保留（例如，可能发生离子交换相互作用） 。

• 在方法开发过程中，可选择流动相pH对保留和选择性进行优化。

• 为延长柱寿命，避免使用极端 pH 值（极高或极低）。可以使用缓冲液帮助调节 pH 值。缓冲液可以保持pH不变，提高重现性。

• 选择流动相改性剂时，一定要考虑检测器；与 UV 检测器匹配良好的改性剂不一定与 MS 检测器兼容。

• 成功的HPLC分离不必完全抑制离子化，通常在流动相缓冲容量足够的情况下，90% 的抑制即可。

• 流动相的缓冲容量与配制的摩尔浓度，以及洗脱液的 pH 与缓冲离子 pK 的接近程度有关 通常在高于或低于缓冲离子 pK 1 个 pH 单位内，可以起到缓冲效果。

• 色谱操作者也可以选择非缓冲的流动相进行 pH 调节。这对于酸性分析物而言也是常用的，用单一的酸溶液进行色谱分离，酸的浓度应足以使pH比需要值低得多，以防止化合物离子化。

• 对于碱性物质的分离，选择是比较有限的。TEA（三乙胺）不能完全溶于水，而且 pK (11) 很高，氨本身可以完全溶于水，但对大多数色谱柱来说pK值过高。

• 测定流动相pH时，要在水相与有机改性剂混合之前在水相中进行测定，以确保得到准确而可重复的结果。

• 选择缓冲盐时注意缓冲盐与检测的相容性，对于UV检测器来说，在目标波长下缓冲液应完全透光。缓冲液UV截止波长*好低于220 nm。

• 流动相会因为实验室中的混合方式而不同。例如，如果要配制甲醇/水=50/50的混合溶剂，应先量取各自的体积，分别置于洁净的玻璃容器中，然后再将其混合，因为甲醇和水混合溶剂的总体积大于各自体积之和。如果在同一个容器中混合，混合溶剂的总体积就会不同。

• 流动相脱气也很重要。在流路中，溶解在溶剂中的气体可能逸出，形成气泡，并有可能干扰泵或检测器的性能。因此我们在配置好流动相之后一定要对其进行脱气处理，脱气处理完之后切记不要再对其进行剧烈振摇。

• 使用正常工作的 pH 计。按照目标pH值校正pH计。用pH计对pH进行可靠的测量非常重要。

• 确保试剂尽可能新鲜。

• 先把固体溶解在非常接近终体积的液体中。调节pH到目标值后，再添加液体使溶液达到目标体积。

• 缓冲液配制完成后，在 HPLC 系统上使用之前要进行过滤，去除水或盐中可能存在的颗粒。大多数HPLC应用都使用0.45 m滤膜；UHPLC则使用0.22 m滤膜。

做分析方法开发我们需要二极管阵列检测器，选择检测波长和做色谱峰纯度检查，通过色谱 峰纯度检查来保证主峰里没有掩盖其它杂质，做纯度检测对波长选择的要求比较简单，原则 是把尽量多的杂质在色谱图上体现出来。很多杂质只有在低波长下才有紫外吸收，所以我们 选择尽可能低的波长，乙腈的截止波长在 190~195nm，用乙腈做流动相检测波长可以选择 在 210~220nm。也有公司要求分别选取产品紫外吸收*强的波段和 210~220nm 两个波段做 对比，哪个纯度低以哪个为准，这样可以更严格的控制产品的质量。

更缓的梯度斜率可以提高分离度，降低梯度斜率将降低灵敏度， 更陡的梯度斜率可能压缩色谱峰，经常会导致分离度的降低， 增加梯度斜率将增加灵敏度， 改变梯度斜率时要平衡峰高与分离度的关系。

温度会影响色谱分析中的每一个化学过程，例如增加温度会降低移动相的粘度，如果流动速度恒定将导致系统背压降低，高温将改变固定相和流动相之间的分配速率，然而由于提高了被测物分散性，会加快优化线性速度。对温度变化敏感的化合物，温度的微小变化都会导致选择性发生独特变化。在这里我们要注意选择柱温一要考虑色谱柱的承受范围，二要考虑该温度下，检测成分是否会降解。